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A edição genética hoje e sua importância para a bioética


Texto original: Observatorio de Bioética

Tradução: João Souza


“Com o descobrimento do CRISPR/Cas9, a edição genética chegou para ficar.”

Fonte: Google Imagens

Poucos avanços científicos são tão transcendentais como a descoberta da técnica CRISPR/Cas9 (Clustered regularly interspaced short palindromic repeats) como ferramenta de edição genética. CRISPR/Cas9 é um sistema natural que atribui resposta adaptativa às bactérias frente a vírus. Em 2012, Jennifer Doudna e Emmanuelle Charpentier publicaram um artigo no qual se detalha como este sistema pode ser utilizado para realizar a edição genética programada em diferentes tipos celulares (1). Pesquisas anteriores já haviam descoberto outras técnicas de edição genética, como a TALENs (transcription activator like effector nucleases) ou a ZFNs (zinc finger nucleases). Contudo, a complexidade na implementação, o alto custo e eficácia limitada ou moderada impediram que seu uso fosse generalizado, apesar de que em alguns casos, sua aplicação gerou bons resultados. A técnica CRISPR/Cas9 resolve estas três dificuldades, e, portanto, tem sido difundida rapidamente a laboratórios de todo o mundo, colocando as técnicas anteriores em segundo plano. Assim, o número de publicações deste campo científico aumenta rapidamente. Parece certo afirmar que, com a descoberta da CRISPR/Cas9, a edição genética chegou para ficar.

História

Em 1987 se publica o primeiro artigo que trata de sequências repetidas no genoma de bactérias, mais especificamente das Escherchia coli (2). Em um primeiro momento pensava-se que estas sequências repetidas não apresentavam nenhuma função.

No ano de 1993, o espanhol Francisco Martínez Mojica descreveu esta mesma sequência em um outro tipo de bactérias, as Haloferax mediterranei, cujo habitat se localiza única e exclusivamente nas salinas de Santa Pola (3). Em 2000, Martínez Mojica descreve esta mesma sequência em um outro grupo de bactérias, as quais denominou SRSRs (short regularly spaced repeats) (4). Dois anos mais tarde, Ruud Jansen identifica genes associados a estas sequências repetidas, e, com a aprovação de Martínez Mojica, rebatiza as sequências genéticas repetidas, que passam a se chamar CRISPR (5). No ano de 2005, Martínez Mojica identifica semelhanças entre os espaçadores associados à CRISPR, descritos por Ruud Jansen e o material genético de certos vírus que afetam bactérias. É neste momento que o sistema CRISPR é identificado como um sistema de defesa das bactérias frente a vírus, sendo que este sistema é hereditário aos processos de reprodução das bactérias (6). As descobertas de Mojica fundamentaram as bases para o posterior desenvolvimento da técnica de edição genética, o que lhe rendeu uma nomeação ao Prêmio Nobel de Medicina de 2016, que foi vencido por Yoshinori Ohsumi.

No ano de 2012, a equipe liderada por Doudna y Charpentier realizou o primeiro “corte” com o sistema CRISPR/Cas9 em um tubo de ensaio, e intuíram que os resultados poderiam ser replicados em outros tipos de células, como as eucariontes, e que poderiam ser utilizados para a edição genética. Por isso, as pesquisadoras foram agraciadas com o prêmio Princesa de Austrias de pesquisa científica e técnica em 2015.

Posteriormente, neste mesmo ano, Feng Zhang conseguiu realizar o primeiro corte utilizando a CRISPR/Cas9 sobre o genoma de uma célula viva de mamífero (7). Zhang conseguiu registrar este feito no registro de patentes dos Estados Unidos. Atualmente, este registro se encontra em um processo judicial com as pesquisadoras Doudna e Charpentier.

Emmanuelle Charpentier e Jennifer Doudna

 

Como funciona a CRISPR/Cas

As bactérias são células procariontes, isso significa que seu DNA não se encontra protegido em um núcleo celular, ficando solto no citoplasma. Disto se deriva a necessidade de um sistema defensivo, o sistema CRISPR/Cas, que tem demonstrado ser de grande importância para a sobrevivência bacteriana, pois caso as sequências CRISPR sejam eliminadas, as bactérias morrem (6).

No meio natural, quando uma bactéria detecta a entrada de um DNA viral, envia uma sequência de RNA capaz de “copiar” até 20 nucleotídeos do DNA do vírus. Então a sequência cópia se une à proteína de corte Cas. Uma vez que as sequências estejam unidas, o RNA com os 20 nucleotídeos copiados encontra o local de encaixe com o DNA viral, se une, e a proteína Cas9 realiza um corte no DNA invasor.

Usos das técnicas de edição genética

É só o começo do vislumbre com a enorme quantidade de possibilidades que esta nova ferramenta biotecnológica oferece, que além das múltiplas aplicações no campo da medicina, tem aplicações ambientais, agrícolas e pecuárias, cujos aspectos éticos são abordados no aqui no GEDbioética.

As aplicações sanitaristas são as que mais despertam interesse, por seu impacto direto sobre a vida das pessoas, e são também as mais controversas, principalmente no que se refere à modificação genética da linha germinal (gametas e embriões).

Centenas de pesquisas neste assunto estão sendo realizadas, com os mais variados objetivos, que vão desde a criação de novos métodos para combater enfermidades que têm tratamentos escassos, como o HIV ou diversos tipos de câncer, até a possibilidade de tratamento para patologias genéticas. Neste sentido, recentemente se aprovou nos Estados Unidos, o que seria o primeiro ensaio sobre os seres humanos no país. Neste ensaio, foram selecionados 18 sujeitos com diferentes tipos de melanoma, mieloma e carcinoma que não responderam aos tratamentos regulares. As expectativas depositadas sobre estes ensaios são enormes, já que oferece uma possibilidade de combate ao câncer de forma eficiente e pouco invasiva, dispensando os tratamentos atuais que se baseiam em cirurgia, quimioterapia e radioterapia (8). Entretanto, cientistas chineses se adiantaram e utilizaram a técnica em um paciente com câncer de pulmão, o qual receberá acompanhamento médico para comprovar e eficácia e segurança do método.

Apesar das importantes ressalvas existentes na comunidade científica (9), (10), já foram realizados dois estudos envolvendo embriões (11), (12), ambos na China. Os embriões utilizados em ambos eram inviáveis.

A verdade é que a comunidade científica está em acordo praticamente unânime quanto à não utilização das ferramentas de edição genética de forma não terapêutica (por exemplo, para  a escolha da cor dos olhos), dito de outra forma, para o “aprimoramento” genético, por não ser aceitável de um ponto de vista ético, é também verdade que a comunidade está atualmente dividida em dois grandes grupos, os que rejeitam esta tecnologia pelos problemas éticos que a terapia germinal implicam, e os que afirmam que seu uso para evitar enfermidades genéticas pode ser legitimado. Esta divisão só diria respeito ao uso da edição genética sobre a linha germinal, já que há um amplo consenso a favor de seu uso em células somáticas.

Fonte: Google Imagens

 

Contudo, parece que a tendência é aceitar que as pesquisas envolvam embriões, desde que a implementação não ocorra no útero da mulher. De fato, na Inglaterra estudos deste tipo já são autorizados. Do nosso ponto de vista, isto é moralmente inaceitável, já que o embrião humano tem uma dignidade equivalente à da pessoa nascida. Pode se levar em conta uma reflexão sobre a modificação genética de embriões humanos para o tratamento de enfermidades.

Há um estudo realizado em 39 países para tentar esclarecer qual é a situação legal atual a respeito da edição genética sobre células germinais (13). Este trabalho revela o seguinte sobre estes 39 países:

  • Em 25 o uso é proibido por lei. Neste grupo se encontram Austrália, Áustria, Bélgica, Brasil, Bulgária, Canadá, Costa Rica, Dinamarca, Finlândia, França, Alemanha, Israel, Itália, Lituânia, México, Nova Zelândia, Singapura, Coreia do Sul, Suécia, Suíça, República Checa, Noruega, Reino Unido, Portugal e Espanha. Este é o grupo mais amplo, e engloba a maioria dos países da Europa ocidental.
  • Em 4, a proibição acontece por meio de diretrizes, que são menos restritivas, e podem estar sujeitas à modificações com mais facilidade que uma lei. Este é o caso da China, Japão, Índia e Irlanda.
  • Em 9, as leis são ambíguas. Neste grupo se encontram Argentina, Chile, Colômbia, Grécia, Islândia, Peru, Rússia, Eslováquia e África do Sul.
  • Em 1, o uso é restritivo. Este é o interessante caso dos Estados Unidos. Existem duas agências estatais envolvidas. A FDA (Food and Drug Administration) regula os estudos clínicos, enquanto o NIH (National Institutes of Health) restringe sua aplicação sobre os seres humanos.

O panorama da regulamentação internacional atual a este respeito sugere que a modificação genética da linha germinal humana não está totalmente proibida, já que existe espaço para a pesquisa em países listados com “ambíguos”. No caso da China e do Reino Unido, estudos assim foram autorizados, apesar da legislação. O mesmo ocorre nos quatro países listados anteriormente com proibições através de diretrizes, que poderiam retirar essas proibições, caso seja ampliada a segurança na correção de genes sobre a linha germinal.

O informe do Nuffield Council on Bioethics sobre edição genética, pulicado em setembro de 2016 (14), mostra que além da medicina reprodutiva, outra área de vital importância a se tratar é a aplicação destas técnicas na agricultura.

Também existe a possibilidade de modificação de ecossistemas. Este é o caso dos mosquitos, grandes vetores transmissores de diversas doenças de difícil controle. Se especula pela possibilidade de alterar geneticamente a uma série de indivíduos e liberá-los no meio natural para que interajam com suas respectivas populações, e, assim, transmitam a modificação genética desejada. Neste sentido, se propôs combinar a CRISPR com a técnica do gene drive, o que permitiria alterar quase qualquer gene em qualquer espécie com reprodução sexual e propagar as alterações produzidas através das populações silvestres.  Apesar disso, as consequências da modificação de uma população inteira são desconhecidas e preocupantes. Assim, a National Academy of Sciences dos EUA lançou um guia de pautas a serem seguidas para uma conduta responsável de pesquisas que envolvam o gene drive.

Com o objetivo de discutir as implicações científicas, médicas, legais e éticas destes avanços, Doudna promoveu uma reunião com especialistas em diversos âmbitos científicos em janeiro de 2015 em Napa (Califórnia), para identificar uma série de passos a serem seguidos (9).

A importância para a bioética

No caso dos usos da edição genética no setor primário, agricultura e pecuária, só cabe estar a favor de todos os usos que tragam benefícios para a humanidade. Seria necessária uma análise caso a caso, descartando os usos em que o benefício buscado seja menor que o potencial risco da manipulação genética. Por exemplo, a manipulação de espécies vegetais para que sejam resistentes a diversos tipos de praga oferece um grande benefício à humanidade, como a diminuição do uso de praguicidas e outros produtos químicos para a proteção da colheita, já que estes podem se dispersar pelo ar, chegando a centros urbanos ou infiltrando-se em aquíferos subterrâneos. É importante ressaltar que, em certos casos, o problema pode não ser de segurança, mas de justiça. Deve se garantir que qualquer avanço nesta área não implique em algum tipo de exploração. Por outro lado, deverá se regular para que informações de procedência dos produtos cheguem ao consumidor final, mediante etiquetas.

A intervenção sobre os ecossistemas deveria ser implementada com mais cautela, já que qualquer alteração pode acarretar problemas incalculáveis e de extrema gravidade, inclusive a nível mundial, já que os meios naturais não se contém às fronteiras políticas.

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No caso das aplicações médicas, o uso das técnicas de edição genética sobre os seres humanos mais próximo ao nosso tempo seria sobre as células somáticas. De fato, o primeiro estudo deste tipo já foi autorizado. Ainda que altamente promissoras, as pesquisas neste campo ainda têm um longo caminho a percorrer. Os cientistas têm grandes expectativas a este respeito, muitos estudos têm sido realizados e enormes recursos estão sendo investidos. Para que o uso desta técnica seja aceitável, deve se aumentar a segurança e seu uso deve ser restrito às patologias para as quais atualmente não existam tratamentos efetivos, ou em enfermidades para as quais os tratamentos atuais possam trazer efeitos colaterais, seu índice de êxito e de efeitos colaterais deveriam ser equivalentes aos dos tratamentos atuais.

Mas, se há um uso desta técnica que é cercado de controvérsias, é seu uso em células germinais. A controvérsia vem, baseada, a cima de tudo, pela hereditariedade das mudanças executadas no DNA destas células. A história da genética é relativamente recente, portanto, ainda carece de pesquisas. Ao tratar da linha germinal e de modificações hereditárias, não deveríamos admitir nenhuma dúvida em relação a qualquer mecanismo implicado no processo. Se na edição genética das células somáticas cabe exigir uma aplicabilidade e segurança iguais ou superiores a dos medicamentos tradicionais ou a das vacinas, na modificação da linha germinal deveriam ser de 100%.

Por outro lado, para que esta técnica seja aplicada, o uso da fecundação in vitro se faria necessário, com as implicações éticas que ela representa. Além disso, no caso da aplicação destas técnicas já se inclui o diagnóstico genético pré-implantação (DGPI), o que implica que a edição genética neste caso poderia não ter utilidade.

Ainda que os benefícios potenciais sejam muitos, o número de beneficiários é reduzido, e os riscos a serem assumidos são incalculáveis, afetando toda a espécie de maneira irreversível. A edição genética sobre a linha germinal, seria, consequentemente, inaceitável, do ponto de vista ético.

Limitações da CRISPR-Cas9 e alternativas

Apesar do grande potencial, a técnica CRISPR-Cas9 também apresenta limitações, frente às quais surgem diversas alternativas (15).

Os componentes do sistema CRISPR-Cas9 (a enzima chamada Cas9 e a hélice do RNA que dirige esta enzima à sequência desejada do DNA) são muito grandes para que se introduzam no genoma do vírus mais comumente utilizado em terapias genéticas para transportar material genético estranho ao interior das células humanas. Uma solução se apresenta na forma de uma mini-Cas9, que foi obtida da bactéria Staphylococcus aureus (16). Esta enzima é suficientemente pequena para caber no vírus. No último dezembro, dois grupos utilizaram o mini-Cas9 em ratos para corrigir o gene responsável pela Distrofia muscular de Duchenne (17), (18).

A enzima Cas9 nem sempre corta onde se pretende – uma determinada sequência de DNA deve estar próxima para que isto ocorra -, esta demanda se supre facilmente em muitos genomas, mas pode significar uma limitação a alguns experimentos Os pesquisadores estão procurando em micróbios para obter enzimas com diferentes requisitos para ampliar o número de sequências que possam ser modificadas. Uma destas enzimas, chamada Cpf1, pode se tornar uma alternativa atrativa. Menor que a Cas9, tem diferentes requisitos de sequência e é altamente específica (19). (20). Outra enzima, chamada C2c2, se dirige ao RNA, no lugar do DNA, característica pela qual tem um grande potencial para estudar o RNA e lutar contra vírus com genomas de RNA (21).

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Muitos laboratórios utilizam a CRISPR-Cas9 só para eliminar as secções em um gene, eliminando, assim, sua função. Aqueles que querem trocar uma sequência por outra enfrentam em uma tarefa ainda mais difícil. Quando a Cas9 corta o DNA, a célula comete erros ao juntar as extremidades soltas, obtendo-se assim, as deleções desejadas. Mas, os pesquisadores que querem rescrever uma sequência de DNA se baseiam em uma via de reparação diferente que pode inserir uma nova sequência – um processo que ocorre a uma frequência muito mais baixa. Mas, nos últimos meses, pesquisadores anunciaram que haviam utilizado e unido a Cas9 e à uma enzima que converte uma letra de DNA em outra. A Cas9 inutilizada, ainda dirige a sequência citada por seu RNA guia, mas não a corta: em seu lugar, a enzima unida muda as letras de DNA, em última instância, produzindo um T, onde era um C (22). Um artigo, recentemente publicado na Science, apresenta um resultado similar (23).

Em maio, um artigo da Nature Biotechnology (24) fez conhecer um novo sistema de edição genética. Os pesquisadores afirmaram que podiam usar uma proteína chamada NgAgo para cortar o DNA em um lugar pré-determinado sem a necessidade de um guia RNA ou uma sequência vizinha específica de genoma. Em seu lugar, a proteína – de origem bacteriana – se programa usando uma sequência curta de DNA que corresponde à zona objetivo. Contudo, os laboratórios têm fracassado até o momento em reproduzir os resultados, o que impede a confirmação da aplicabilidade efetiva desta técnica. Mas, ainda há esperança de que as proteínas da família a qual pertence a NgAgo – Ago ou Argonautas – realizadas por outras bactérias poderiam funcionar.

Também existem outros sistemas de edição genética, alguns dos quais são conhecidos há anos. Para um projeto amplo que tinha como objetivo modificar genes em bactérias, o laboratório de Church não utilizou a CRISPR. Em seu lugar, a equipe se baseou, em grande medida, em um sistema chamado lambda Red, que pode ser programado para alterar sequências de DNA sem a necessidade de um RNA guia. Mas, apesar de 13 anos de pesquisa no laboratório de Church, o lambda Red só funciona em bactérias.

Church e Feng Zhang, bioengenheiro do Instituto Broad do MIT e Harvard em Cambridge, Massachusetts, dizem que seus laboratórios também estão trabalhando no desenvolvimento de enzimas chamadas integrase e recombinase para seu uso como editoras de genes.

 

Referências

 

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